DNA sekventering

DNA-sekvensbestemmelse gør brug af metoden dideoxysekventering, der er udviklet af nobelpristageren Frederic Sanger. Det er samme metode, der er udnyttet til bestemmelse af sekvensen af det menneskelige genom.

Metoden efterligner cellernes kopiering af DNA’et, idet man bruger enzymet DNA-polymerase. Først syntetiseres et lille stykke DNA – en primer, der er ca. 20 nucleotider lang. Primeren kan base-parre til det område, der ønskes sekventeret (target-DNA). Der findes synteseapparater, der kan lave små stykker DNA, se figur 7.

Target-DNA’et opvarmes, hvorved samtlige hydrogenbindinger mellem baserne brydes, og DNA-strengene går fra hinanden. Herefter tilsættes primeren, og temperaturen sænkes (Fig. 7, A). Primeren finder hurtigt det sted på target-DNA’et, hvor den kan lave den optimale base-parring ved hydrogenbinding og danne et lille stykke dobbelthelix.

Efterfølgende tilsættes DNA-polymerase og de fire nucleotider (Fig. 7, B). Alle disse har tre phosphatgrupper (nucleotidtriphosphat). Polymerasen starter ved primeren og syntetiserer herfra den modsatte kopi af target- DNA’et. Polymerasen kan indbygge ca. 1.000 nucleotider pr. minut!

Frederick Sanger udviklede nogle modificerede nucleotider, som netop mangler den hydroxygruppe, der skal reagere med phosphatgruppen på det næste nucleotid i DNA-sekvensen. Disse modificerede nucleotider (dideoxynucleotidtriphosphat, ddNTP, se nedenstående figur) virker som stopklods ved DNA syntesen.

Hvis man tilsætter en lille smule ddATP til reaktionen fra før, vil syntesen af en del af kopierne standse ved et A. Deler man sin reaktion fra før i fire portioner og tilsætter hver portion en smule af én af de fire ddNTP’er, vil der i hver portion dannes fragmenter, som standser henholdsvis ved A, T, G og C.

Figur 7

Da der syntetiseres mange kopier i hver portion, vil der i hver portion findes DNA-fragmenter af alle mulige længder, som dog alle standser på den base, der tilsat som dideoxystopklods (Figur 7, C). Efterfølgende analyseres alle fragmenternes størrelse (længde) ved gel-elektroforese.

Denne analyse skiller fragmenterne efter størrelse, hvor de mindste bevæger sig hurtigst og dermed længst. Ved at placere de fire reaktionsprodukter ved siden af hinanden i gelen vil man efter elektroforesen se et mønster af bånd på gelen. Hvert bånd repræsenterer et fragment, der standser ved en given base. Læses båndene fra den korteste ende, kan DNA-sekvensen aflæses (prøv om du kan læse sekvensen på Fig. 7, D).